Om te onderzoeken of PUMA essentieel is voor de inductie puma classic suede van apoptose in GBM, werd PUMA-specifiek siRNA gebruikt om PUMA-expressie en de respons van U87MG GBM-cellen, die zeer lage EGFR-niveaus tot expressie brengen, op anisomycine, een krachtige inductor van transcriptie, naar beneden te reguleren apoptose [38] werd onderzocht. Zoals getoond in Fig. 3a, toonde de TUNEL-test aan dat PUMA knockdown U87MG-cellen resistent maakt tegen apoptose (2,5%), geïnduceerd door 48 uur anisomycinebehandelingen. Daarentegen ondergaan U87MG-cellen die zijn getransfecteerd met het controlesiRNA significante anisomycine-geïnduceerde apoptose (45,5%).

In de test vertegenwoordigen de gele samengevoegde signalen nucleair gefragmenteerd DNA. Zoals verwacht, vertoonden onbehandelde cellen geen bewijs van apoptose (gegevens niet getoond). De western blotting (Fig. 3b) gaf aan dat PUMA-expressie specifiek en efficiënt werd gereguleerd door de PUMA-specifieke siRNA. Effecten van PUMA-expressie down-regulatie en verhoogde EGFRvIII-expressie op de inductie van apoptose in GBM-cellen. De puma fenty slippers mate van apoptose wordt berekend als: (# apoptotische kernen) / (totaal van kernen). In beide panelen werden 250-300 cellen onderzocht in elk experiment en drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd om middelen en standaardafwijkingen af te leiden.

PUMA-expressie knockdown maakt GBM-cellen resistent tegen apoptose, zoals aangegeven puma slippers fenty door de TUNEL-test. U87MG-cellen werden 24 uur getransfecteerd met controlesiRNA en PUMA-specifiek siRNA en gedurende 48 uur blootgesteld aan 100 ng / ml anisomycine, een krachtige apoptose-inductor. De cellen werden vervolgens onderworpen aan de TUNEL-test om de mate van apoptose te bepalen. Rode fluorescentie: kernen gekleurd door propidiumjodide. Groene fluorescentie: gefragmenteerd DNA. Gele samengevoegde signalen: nucleair gefragmenteerd DNA. ( Western blotting duidt op specifieke en efficiënte PUMA-expressie knockdown na transfectie van PUMA-specifiek siRNA, maar niet op niet-targeting siRNA. (C) Verhoogde EGFRvIII-expressie verleent weerstand van GBM-cellen tegen apoptose.

Naast GBM-cellen hebben we gevonden dat PUMA [url=hhttp://www.corruptct.com/puma-c-1/puma-thunder-desert-c-1_21/]puma thunder desert[/url] gelokaliseerd is in het cytoplasma van MDA-MB-468 menselijke borstkankercellen (Fig. 5d) waarvan bekend is dat ze significante niveaus van endogene EGFR tot expressie brengen [34]. Samen tonen deze resultaten aan dat PUMA wordt gesekwestreerd in het cytoplasma van EGFR- en EGFRvIII-expressie GBM en borstkankercellen, constitutief en onder apoptotische stress. Om inzicht te krijgen in de factoren die de interactie van EGFR met PUMA moduleren, hebben we de eis onderzocht van EGFR-activering voor de EGFR-PUMA-interactie. Fig. 6a (linkerpaneel) laat zien dat het vermogen van EGFR om te binden aan PUMA vergelijkbaar was in U87MG-EGFR-cellen met en zonder EGF-stimulatie na serumhongering.

Zoals aangegeven door de afwezigheid van auto-gefosforyleerde EGFR (p-EGFR, Y1068), brengen serum-uitgehongerde U87MG-EGFR-cellen inactieve EGFR tot expressie (Fig. 6a-rechts). Daarentegen wordt p-EGFR gemakkelijk gedetecteerd in met EGF behandelde cellen, hetgeen aangeeft dat EGF EGFR efficiënt in deze cellen activeerde. Om verder te bepalen of EGFR-kinase-activiteit vereist is voor de EGFR-PUMA-interactie, hebben we U87MG-EGFR-cellen behandeld met een EGFR-kinaseremmer met klein molecuulgewicht, Iressa, die in klinisch gebruik is om EGFR-activiteit te remmen. Zoals getoond door Fig. 6b (linkerpaneel), veranderde Iressa de puma dames EGFR-binding aan PUMA niet, maar zoals verwacht verlaagde het het niveau van EGFR-autofosforylering / activering aanzienlijk.

Western blotting werd uitgevoerd om expressieniveaus voor anti-apoptotische leden van de Bcl-2-familie van eiwitten te bepalen. Blijkbaar komen Bcl-2 en Bcl-xL sterk tot expressie in de meerderheid van de geanalyseerde GBM-cellijnen, maar niet Mcl-1. (D) Herstel van intrinsieke apoptose sensibiliseert EGFR / EGFRvIII tot expressie brengende GBM-cellen voor EGFR-gerichte therapie. U87MG-EGFR- en U87MGEGFRvIII-cellen werden behandeld met alleen Iressa (0-100 uM), 2-MA A3 (een Bcl-2 / Bcl-xL-remmer en een krachtige apoptose-inductor; 0-100 uM) alleen en in

combinatie met de molverhouding van 1: 2 (Iressa: 2-MA A3).